Ambrosini ha esordito in Nazionale maggiore il 28 aprile 1999 a Zagabria contro la Croazia. Dopo 2 anni di assenza, Ambrosini è tornato nel giro della Nazionale nel 2006, nella gestione di Roberto Donadoni. Dopo il suo positivo rientro nel gruppo, è stato inserito nella lista dei 23 convocati per gli Europei 2008 in Austria e Svizzera.Ha collezionato 35 presenze in Nazionale di cui una da capitano il 16 agosto 2006 in Italia-Croazia.

Dalla stagione 1998-1999 è definitivamente rossonero. La stagione 1999-2000 si è rivelata importante per la definitiva consacrazione di Ambrosini, che ha collezionato 29 presenze in campionato, 4 in Coppa Italia e 2 in Champions League. Nonostante gli infortuni Ambrosini è riuscito a ritagliarsi uno spazio importante. Nella stagione 2001-2002 ha segnato contro il Torino il gol-vittoria e ha dato inizio alla rincorsa al 4° posto, conclusasi poi positivamente. Il 31 agosto 2007, vista l'assenza di Paolo Maldini, a Monte Carlo è stato Ambrosini, con la fascia di capitano, a ricevere ed alzare al cielo la Supercoppa UEFA vinta contro il SivigliaNella stagione 2009-2010, dopo il ritiro di Maldini, Ambrosini è diventato il capitano del Milan.

Nell'estate del 1997 il Milan ha ceduto Ambrosini in prestito al Vicenzaper permettergli di giocare con continuità e fare esperienza.

A 17 anni viene inserito in prima squadra ed esordisce nella partita di Coppa Italia Cesena-Genoa. Nel campionato di Serie B gioca da protagonista totalizzando 25 presenze e 1 gol.